DNA合成-疑难解答

A：Oligo DNA制品呈现白色粉末或无色透明均为正常形态。我公司提供的Oligo DNA制品为白色粉末或絮状物，一方面客户能肉眼观察到白色制品，另一方面保证Oligo DNA能即刻溶解。但由于Oligo DNA制品受空气中水份的影响，制品被潮解而吸附于离心管壁或管盖上，呈现无色透明状或难以观察到，遇到这种情况时请在使用前先离心收集Oligo DNA制品于管底，然后溶解Oligo DNA制品。

Q：如何稀释Oligo DNA制品?

A：收到Oligo DNA后，首先请短暂离心，收集Oligo DNA制品于管底，然后慢慢打开管盖，加适量的无菌超纯水或TE缓冲液，盖上管盖，充分上下振荡或用手指弹管底，使Oligo DNA充分溶解。相关的说明及数据请参照我公司的DNA合成报告单。下面举例说明：
例：您得到一管标为5 OD₂₆₀的20mer Oligo DNA： TGG GCG GCG GTT GGT GTT AC A=1 C=3 G=10 T=6 MW=(1×312)+(3×288)+(10×328)+(6×303)-61=6213 关于分子量，您也可以采用平均分子量的近似算法：
MW=20×324.5=6490
质量数=5×33=165μg
摩尔数=165/6490=0.025μmol=25nmol
若加入250μl超纯水溶解，
则浓度为：25nmol/250μl=100μM=100pmol/μl

Q：怎样制备100mM的储备液?

A：体积（μl）=DNA合成报告单上的nmol数目×10

Q：Oligo DNA制品如何保存?

A：（1）Oligo DNA干燥制品很稳定，常温下可保存数月，但最好置于-20℃保存。（2）溶解后的DNA溶液可于4℃短期保存，长期保存请置于-20℃。在溶解和使用DNA溶液时，请避免核酸酶污染，减少DNA溶液的反复冻融。（3）荧光标记Oligo DNA对光敏感，在日光下荧光强度会降低。为了保持荧光标记Oligo DNA 的荧光效率，请于-20℃避光保存。 Cy3与Cy5在溶液pH>9的条件下会发生分解，所以稀释Cy3与Cy5标记的Oligo DNA 时请注意溶液的pH值。

Q：Oligo DNA制品在常温下放置了一周还能正常工作吗？

A：Oligo DNA的干燥制品是非常稳定的，即便在溶液中也很稳定。一般情况下，只要没有核酸酶、细菌等的污染，Oligo DNA制品于常温下放置一周仍然能够正常工作，但长期保存请最好置于-20℃。

Q：Oligo DNA 制品可以用琼脂糖凝胶电泳检测吗？

A：由于化学合成的寡核苷酸所具有的特性，不能使用Agarose Gel及EB染色方法进行质量和浓度检测，必要时请使用变性PAGE电泳检测。主要原因如下：
（1）Oligos是单链DNA，容易形成立体结构。跑琼脂糖凝胶电泳时，容易出现多条带。
（2）Oligos为单链，而EB染色是嵌入到DNA 双链的碱基之间。因此，单链DNA形成的立体结构越复杂，EB染色就越容易，DNA 条带就越亮。如果单链DNA不形成立体结构，EB就无法染色。

Q：长度相同、碱基组成不同的Oligo DNA进行变性PAGE电泳时，电泳带应该在同一位置吗？

A：对于短链DNA来说，会有差异，但长链DNA 差别很小，主要原因如下：
（1）A、G、T、C组成不同，电泳速度不同。
（2）DNA立体结构不同，电泳速度不同。

Q：含有较长的连续鸟嘌呤的寡核苷酸可以合成吗？

A：我公司成功的合成过含有连续15个鸟嘌呤以上的寡核苷酸。高嘌呤含量的寡核苷酸，特别是含有较长的连续鸟嘌呤的寡核苷酸，有发生聚集的倾向而形成guanine tetraplex，纯化时需要较强的变性条件，而变性剂往往会危害到寡核苷酸的具体应用。通过Inosine替换其中的一些鸟嘌呤，可一定程度降低guanine tetraplex的形成。

Q：如何制备双链DNA?

A：（1）用退火缓冲液（10mM Tris pH8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA）溶解单链DNA，浓度为1~5OD/100μl。
（2）将两条互补单链等摩尔数混合。
（3）94℃温浴2~5分钟，然后缓缓冷却到室温（25℃以下）。
（4）4℃保存备用。

Q：普通合成的Oligo DNA 5'末端带磷酸基团吗？

A：不带磷酸基团。Oligo DNA的5'末端和3'末端均为-OH基。如果合成Oligo DNA时需要带磷酸基团，请特别注明，同时我公司需收取磷酸化修饰费用。

Q：常用简并Oligo DNA（混合碱基）的代码：

A：M=（A/C），W=（A/T），H=（A/T/C），V=（G/ A/C），D=（G/A/T），Y=（C/T），K=（G/T）， S=（G/C），B=（G/T/C），N=（A/G/C/T），R= （A/G）。

Q：简并性Oligo DNA对PCR扩增的影响?

A：通常一条Oligo DNA中简并的碱基不要超过4 处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效Oligo DNA的量相对减少，此时应适当增加Oligo DNA的使用量。但Oligo DNA量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。

Q：合成的Oligo DNA多次PCR无目的产物。

A：如果PCR后无目的产物，可以从以下几方面寻找原因：（1）Oligo DNA设计是否合理。（2）Oligo DNA和模板是否配对或同源性有多大。（3）PCR反应试剂是否存在问题：模板DNA、DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Oligo DNA等。（4）PCR仪是否正常工作。（5）退火温度及其它反应条体是否优化。（6）模板是否存在复杂结构：GC含量高、重复序列等。影响PCR失败的因素很多，可从多方面分析考虑，若仍然扩增不出带，可要求我公司重新合成Oligo DNA，以排除合成因素的影响。

Q：进行反义DNA（antisense DNA）实验时，对DNA 链是采取点硫代还是全程硫代修饰？

A：进行硫代磷酸酯寡核苷酸合成时，寡核苷酸间非桥键的等价氧之一被硫所取代，形成了一个手性硫代磷酸二酯，一种体内核酸酶代谢的拮抗剂。特定的片段使特定基因表达中的mRNA 转录无效，这种现象被称为“反义效应”。为了取得最好的保护效果，许多学者将整条链进行硫代修饰，但这样会使碱基的配对效率降低。因此，通常将片段的两端进行硫代修饰，这样也可取得良好的保护效果，同时又可避免中央片段配对效率的降低。但具体的实验方案须根据您的实验目的及要求决定。

Q：PCR产物经克隆后测序发现Oligo DNA处碱基有误，为什么？

A：
（1）PCR过程的错配：DNA聚合酶忠实性低、循环数太多、四种dNTP的浓度不同都可能导致在PCR产物序列中Oligo DNA错误。
（2）克隆过程中引起的突变。
（3）测序导致的错误。
（4）合成仪管路的瞬时阻堵，结果引起单个碱基或一部分碱基缺失。
（5）计算机程序失灵导致错误合成。
（6）碱基在偶联到DNA片段之前，碱基与碱基之间发生了偶联，然后再附加到了DNA片段上，导致多碱基现象。
（7）合成过程中出现脱嘌呤，对脱嘌呤后的碱基，DNA聚合酶不能识别，可能导致PCR 后出现A或G缺失。
（8）脱保护不完全导致碱基缺失。
（9）Capping反应不完全，截断DNA（n-1）继续参与后续合成，导致缺失碱基。

出现以上情况的概率极低，您可以通过多挑几个克隆得到解决；您也可以通过点突变的方式予以纠正。如果这两种方式您不愿意做，我们公司可以提供免费合成一次。

Q：能保证合成的Oligo DNA 100%正确吗？

A：不能。Oligo DNA的合成是化学反应的过程，由于化学反应的特性，Oligo DNA的纯度不可能是100%，因此多测几个克隆，也许会挑到正确的克隆。

Q：怎样保证合成Oligo DNA的高正确率？

A：（1）选用高纯度Oligo DNA。（2）选用小于35mer的Oligo DNA。（3）进行克隆实验时需进行测序验证，尤其进行蛋白表达实验时更须如此。

Q：PCR产物可以直接克隆吗？

A：PCR用Oligo DNA的5'端为-OH，因此扩增后的PCR产物5'端也没有磷酸基团。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。建议对PCR用Oligo DNA的5'端进行磷酸化修饰或对PCR产物的5'端进行磷酸化处理。

Q：琼脂糖凝胶分析PCR产物时观察到非特异条带为什么？

可能原因	建议解决方法
形成引物二聚体	设计在3'端没有互补序列的引物。
引物与模板非特异性退火	1、以2℃间隔增加退火温度，减少退火时间。 2、在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。 3、采用Hot start法或Cool start法。
镁离子浓度太高	对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
污染外源DNA	在PCR过程中使用良好的实验步骤减少污染源。
因为二级结构导致引物结合位点无法接近	对于GC%>50%模板，使用改善模板GC含量的优化剂。
引物设计不合理	1、改变引物的位置，增强特异性。 2、增加引物长度，增强特异性。
模板DNA量过多	模板DNA量20%递减。