目 录 号 数 量 价 格 SDM-15 15次 950元

概述

定点突变试剂盒可以在克隆于质粒DNA序列的特定位点诱导突变。理论上可以保证突变率达到100%。整个实验过程简单快捷只需要两个步骤。试剂盒不需要用到M13载体和甲基化步骤。该试剂盒可以诱导某个已知基因的特定碱基进行定点突变、再突变成野生型、密码子突变、插入或者缺失等，因此可以用于功能基因组学和蛋白质组学的研究。另外由于试剂盒能够诱导特异基因突变，又可以应用于蛋白质工程学研究领域。定点突变试剂盒操作十分简单（根据我们提供的引物设计原则设计引物；用Muta-direct™酶进行15~18个循环的PCR扩增反应；Mutazyme™酶处理选择突变克隆；转化）。理论上在LB平板上的克隆100%是突变克隆，通过对突变克隆的测序分析，正确的突变可以应用于后续实验。

产品特点

·操作简便，无需特殊的实验技能

· 2~3天即可完成基因的定点突变

·整个实验过程只需要用到两种酶：Muta-direct™酶和Mutazyme™酶

·广泛的使用范围：可以用于点突变（Point mutation），缺失突变（Deletion）和插入突变（Insertion）等。

· 100%的突变效率

贮存条件

请将试剂盒中提供的各种试剂于-20℃贮存。由于试剂盒中提供的反应缓冲液及dNTP是为反应专门优化的，所以不要用其它的反应缓冲液及dNTP代替。

试剂盒组成

试剂盒提供的对照模板及引物，可以完成5次对照实验。包括对照反应在内，本试剂盒共可进行15次基因定点突变反应（每次反应体系50μl）。

组成                                次量

Muta -Direct™Enzyme (2.5U/μl)                   15μl

Muta-Direct™Reaction Buffer (10×)                   100μl

dNTP Mixture                                     30μl

Mutazyme™Enzyme (10U/μl)                        15μl

pUC18 Control Plasmid (10ng/μl)                 10μl

Control Primer Mix (20pmol/µl)                       15µl

Competent cells                                  Not provided

定点突变对照实验

试剂盒中提供的对照质粒为pUC18，通过它可以判断实验的成功与否。pUC18质粒包含lac Z基因，用试剂盒中提供的对照引物可以诱导pUC18中丝氨酸（TCG）突变为终止密码子（TAG），这样会导致lacZ基因失活，因此LB平板上的克隆必须都为白色才证明突变成功。对于首次做突变实验的用户，可以通过对照反应观察实验是否成功。

引物设计

n          首先需要进行引物设计，设计时请参考如下原则。

n          通常引物长度为25~45mer，我们建议引物长度为30~35mer。

注：突变位点应该设计在引物的中央位置。

n          如果设定的引物长度为30mer，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。

n          如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。

    ① 设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

    ② 计算引物的Tm值，看是否达到78℃，如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。

    ③ 最好使用经过纯化的引物。

Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5

     注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。

引物设计实例

以 GCG→ACG为例：

         5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’

① 首先设计30mer长的上下游引物，并将A(T)设计在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’

② 引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。

③ 重新调整引物长度。

Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’

Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’

在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。

实验前注意事项

l           试剂盒提供了优化的实验方案，按步骤操作诱导目的基因突变率几乎可达100%。

l           白色菌落的形成与突变效率是不同的，在实验过程中重要的是出现白色单菌落而不是菌落出现的数量。如果出现白色菌落则证明在目的基因上已经发生了突变。有时由于Mutazyme™处理步骤的失误，残留的模板质粒也能形成白色菌落。但如果您操作无误，这种情况一般不会发生。

l           白色菌落的数量与突变率是没有直接关系的，而与PCR反应条件和感受态细胞转化效率有关。

l           如果突变没有出现在目的核苷上时，请检测合成引物的纯度。

l           当PCR反应完成后，Mutazyme™酶的用量就会影响到实验结果。若模板过量会产生阴性结果，因此Mutazyme™和质粒模板的用量必须适当。

l           试剂盒适用于15kb甚至大于15kb的模板突变，但是当所用的质粒模板大于10kb时，白色菌落数量会减少，不过这与突变效率没有关系。

定点突变操作步骤

[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。

1.        设计点突变引物。

  [注]参考引物设计指导

2.        准备模板质粒DNA

  [注]用dam⁺型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。在end⁺型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。

3.        [选项]对照反应体系（50μl反应体系）

10×Reaction Buffer                                      5μl

pUC18 control plasmid（10ng/μl, total 20ng）            2μl

Control primer mix（20pmol/μl）                      2μl

dNTP mixture（each 2.5mM）                            2μl

ddH₂O                                                 38μl

Muta-direct™ Enzyme                                   1μl

4.        样品反应体系（50μl反应体系）

10×Reaction Buffer                                      5μl

Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng）               2μl

Sample primer (F)（10pmol/μl）                          1μl

Sample primer (R)（10pmol/μl）                      1μl

dNTP mixture（each 2.5mM）                           2μl

ddH2O                                                    38μl

Muta-direct™ Enzyme                                  1μl

5.        PCR反应条件

[注]按如下参数设置PCR扩增条件。

Cycles	Temperature	Reaction Time
1cycle	95℃	30sec
15cycle	95℃ 55℃ 72℃	30sec 1min 1min per plasmid Kb

6.        PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。

[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。

Mutation	Cycles
1~2Nucleotide	15cycles
3Nucleotides	18cycles

[B] 突变质粒选择

PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。

1.      准备PCR反应产物。

2.      加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃温育1小时。

[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。

[C]转化

反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam⁺型菌株，例如DH5α。

1.     将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。

2.     接下来可以参照一般的转化步骤进行。

序列分析

通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。

为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。

突变实例

以GGC→GAC为例

[突变反应体系]

10×Reaction Buffer                                        5μl

Sample plasmid（6.3Kb，10ng/μl，total 20ng）          2μl

Sample primer（F）（10pmol/μl）                            1μl

Sample primer（R）（10pmol/μl）                        1μl

dNTP mixture（2.5mM each）                         2μl

dH₂O                                                       38μl

Muta-direct™ Enzyme                             1μl

[PCR条件]

Cycles	Temperature	Reaction Time
1cycle	95℃	30sec
15cycle	95℃ 55℃ 72℃	30sec 1min 1min per plasmid Kb

[序列分析]

突变质粒测序结果

常见问题	解决方案
无单菌落出现	通过电泳检测PCR反应体系 如果是PCR反应的问题可以通过调节退火温度进行解决
	检测感受态细胞的转化效率
突变率低	Mutazyme™酶处理不当 增加Mutazyme™酶用量或延长反应时间
	检查模板质粒用量 质粒用量过多会引起突变率降低
错误突变	检测合成引物的质量