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SLAMseq: High-Throughput Metabolic Sequencing of RNA

   

分析RNA合成的转录组动力学。

检测新生RNA表达和转录的稳定性

为基因表达调控研究带来新视野

QuantSeq 3’ mRNA-Seq结合使用,达到低成本、高通量的代谢测序。

   

简介:RNA的代谢测序

   

   通过标准的RNA-seq方法能够测量总RNA数量,但不能解答更深层次的、决定整体稳态水平的RNA转录与降解的基本动力学问题。RNA代谢测序结合了代谢RNA标记方法与RNA-Seq,使定量分析新合成的RNA(新生RNA)成为可能。现有的代谢RNA-Seq的办法包括用核苷酸衍生物(如4-硫代尿苷)脉冲标记RNA,以及用生化pull-down技术分离新生RNA和现有RNA来制备文库。然而,这个方法不仅耗时耗力,需要大量的RNA投入量,而且经常产生出的信号质量较低。单个转录本的pull-down效率也受到序列属性的影响,意味着实验结果通常只是半定量的。此外,与标准RNA-Seq文库制备方法结合使用,使得这些实验方法价格高昂、分析强度大,特别是考虑到对时间和足够复制数有要求时。

   

   

1 | SLAMseq工作流程。培养细胞过程中使用4-硫代尿苷(S4U)处理,以标记新生RNA(绿色)。提纯出总RNA后添加碘乙酰胺(IAA)诱导4-巯基基团的烷基化。在文库制备过程中,例如使用QuantSeq 3’ mRNA-Seq文库制备试剂盒时,样品中存在的羧酰胺(carboxyamidomethyl)基团导致逆转录酶会在遇到还原的*S4U修饰的核苷酸时的任意位置上配对上鸟嘌呤(G,红色),而不是腺嘌呤(A,黑色)。通过这种方式,在随后的数据分析中,新生的RNA可以通过T>C突变(红星)的存在与现有的RNA区分开来。

   

SLAMseq

   

   Lexogen现在提供给客户一套基于一种全新的、转录组范围的、非侵入性的、定量化、快速可靠的试剂盒:SLAMseq,基于连接的巯基(SH)被烷基化的RNA代谢测序方法。在不需要生化分离技术辅助的情况下,SLAMseq能够在一个总RNA样品中同时对新生RNA和现有RNA进行定量分析。SLAMseq的基本工作流程见图1,可以很容易被应用于活细胞实验中。

与标准的RNA-Seq相比,SLAMseq的工作流程只增加了两步:1)添加S4U到细胞培养基中以标记新生RNA,2)在进行标准RNA-Seq步骤之前,对总RNA进行IAA预处理来诱导4-巯基基团的烷基化。在二代测序数据处理时算法可以通过测序结果中的核苷酸转换位点来区分现有RNA和新生RNA的读取结果,类似于单核苷酸多态性(SNP)分析。此外,对所有获得的读取数据进行评估,能够对稳态下总RNA水平进行定量,这一点与标准RNA-Seq相同。

   

SLAMseq Explorer Kits(测试试剂盒):评估S4U毒性,最佳使用浓度以及掺入率

   

   在不同细胞种类中,S4U的毒性、最适浓度以及掺入率并不相同,因此需要进行预实验来调整具体实验条件。SLAMseq测试试剂盒—细胞活性滴定模块(目录号059),能够初步用来进行一组S4U滴定实验以评估其毒性和最适浓度,即找出在检测新生RNA实验中信噪比最高那组的实验条件。然后使用SLAMseq测试试剂盒—S4U掺入模块(目录号060)与HPLC分析,来测定在预定的最适浓度条件下S4U的掺入百分比。

   

SLAMseq Kinetics Kits(动力学试剂盒):在代谢RNA-Seq中多样化应用

   

SLAMseq可以用于多种研究,包括:

分析mRNA合成和转化率(turnover rates)的动力学原理

检测新生RNA的表达

评估转录的稳定性

The SLAMseq动力学试剂盒 (目录号s 061和062)可以用来进行S4U标记以及S4U标记/尿苷酸终止实验,分别评估合成代谢(RNA合成)或分解代谢(RNA转化)动力学(图2)

   

分析mRNA合成和转化率(turnover rates)的动力学

   

   使用SLAMseq, 在最初S4U标记和随后的尿苷酸终止实验后,依照时间间隔取样,其结果可用于检测转录组范围的RNA动力学。在高分辨率条件下,每个转录本的转录和降解速率可以分别确定(图2)。

   

2 | S4U标记动力学实验揭示单个RNA合成和降解速率。首先用S4U处理细胞24小时来检测RNA的合成。在接下来的24小时中,去除S4U并添加无标记的尿苷酸(U Stop)后,测量RNA的降解率。对于编码如转录因子HES1和JUNB这样的调控蛋白的mRNA来说,它们通常具有较高的合成和转化率,而对于编码如NDUFA7和RSP9这样的“管家基因”则具有较低的转录和mRNA降解率,见Herzog et al., (2017)2。

   

检测新生的RNA表达和转录的稳定性

   

   SLAMseq能够将新合成的RNA与稳态的总RNA区分开来。这就能对新生RNA的表达水平进行特定的分析。同样的,可以评估转录的稳定性和衰减情况。结合这些,可以为转录和后转录水平上的基因表达调控研究提供新的视角。

   

SLAMseq和QuantSeq结合使用,形成完整的高通量代谢RNA-Seq解决方案

   

   将Lexogen的SLAMseq与QuantSeq 3' mRNA-seq Library Prep Kit (目录号s 015和016)结合使用,为高通量的代谢RNA-Seq实验提供了一套完整的解决方案。从SLAMseq实验中获得的总RNA在标记的S4U被IAA烷基化后,可以直接投入用于QuantSeq实验。基于3’端标签的简化的QuantSeq实验可以使文库制备过程时间和成本大大降低。QuantSeq生成文库所需要的读取数比标准的RNA-seq更低,因此可以在单一的测序通道或运行中同时处理从多个时间点和复制中获得的样本。

   

订购信息:

   

产品名称

规格

货号

价格(元)

SLAMseq Explorer Kit - Cell Viability Titration Module, 24 preps

24 preps

059.24

6,840

SLAMseq Explorer Kit - S4U Incorporation Module, 24 preps

24 preps

060.24

8,835

SLAMseq Kinetics Kit - Anabolic Kinetics Module, 24 preps

24 preps

061.24

7,740

SLAMseq Kinetics Kit - Catabolic Kinetics Module, 24 preps

24 preps

062.24

8,610