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肽核酸(PNA)的定制


    定制的肽核酸可以标记或不标记染料及其它化学物质,它们也可以和多肽偶联以增加其功能。标记时,接头(linkers)不仅可以起到空间间隔(spacer)的作用,还能改善其溶解性。Gamma PNA或者修饰的碱基可以更进一步提高肽核酸的解链温度Tm和特异性。


关于肽核酸


   肽核酸 (Peptide Nucleic AcidPNA)  是一种人工合成的类似于 DNA RNA的聚合物。与多肽类似,各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基连接到主链骨架上。由于PNA不带负电荷,与DNARNA之间不存在静电斥力,因而结合的稳定性和特异性都大为提高。不易被DNA酶和蛋白酶水解PNA在体内以及体外极其稳定。



PNA的主要应用


·  序列特异性的PCR抑制剂(PNA夹)

·  端粒、着丝粒FISH探针,基因特异性探针,感染试验

·  反义/抗微生物试剂

·  miRNA抑制剂

·  双链DNA侵入和捕获

·  微阵列探针


非标记PNA

   

   由于其高亲和力和特异性,PNA能有效结合靶核酸。未标记的PNA通常作为基因的PCR反应的特异性阻断剂(PNA夹)。这种技术可以有效地检测靶基因中的SNP突变。

   PNA倾向于定向且逆平行结合到靶核酸。PNA 5' 端的氨基(也写为 5' 或 H-),可以结合其它功能基团,PNA 3' 端的酰胺基(也写为-NH2或3')反应活性弱。5' 端乙酰化可以阻止其继续发生反应。

   因为PNA的解链温度Tm 高于DNA,一般情况下,大部分使用的PNA的长度为10 - 21个碱基。PNA链越长,溶解性越差。嘌呤含量高(>60%)尤其是碱基G,是导致溶解性差的原因。根据序列,PNA链最大长度约为40个碱基。然而,我们强烈建议检查Tm,设计探针应具有适当的长度和序列。

    当PNA链较长(>22mer)或者嘌呤含量高(>60%)时,为了提高PNA探针的溶解性,我们建议在序列中加入一些助溶基团如O linker、E linker、X linker或者两个赖氨酸。当PNA偶联多肽或染料时,接头(linker)可以起到空间间隔(spacer)的作用。

·  可能用到的接头

   - O linker (也称 AEEA 或 eg1):常用来提高溶解性

   - 起到空间间隔作用:O、E、X、C3、C4、C6、C12

   - 加入巯基:C6SH、C11SH

标记PNA


   PNA链5’端和3’端均可以标记。由于3' 端是非活性基团(-CONH2),所以需加入一个赖氨酸,其侧链上的氨基可以用来标记。

   如果在5' 端标记,我们建议在PNA 和标记物之间加 1-2 O linkers。

   标记物:荧光基团(—NHS酯或羧基酰胺)、生物素、棕榈酸、地高辛、DABCYL、叠氮化物、亚甲基蓝、巯基等。



<常见的荧光标记>

Dye

Ex (nm)

Em (nm)

Dye

Ex (nm)

Em (nm)

FAM

492

518

ATTO425

436

484

FITC

492

518

AlexaFlour488

494

517

OregoneGreen488

498

526

TAMRA

553

576

Cy3

550

570

TexasRed

492

576

Alexa546

556

573

Atto550

554

574

AlexaFlour532

530

555

Atto647N

644

667

Cy5

650

670

Alexa647

650

668

Thiazol Orange

510

530

Dabcyl

454

JOE

520

548

BHQ-2

560-670

BHQ-1

480-580

BHQ-3

620-730


肽核酸-多肽


    因为肽核酸主链是基于多聚酰胺连接在一起,肽核酸可以很容易地与多肽结合以增加功能。例如,加入赖氨酸可提高肽核酸的溶解性;加入半胱氨酸可使肽核酸与其它分子通过二硫键连接在一起。

    PNA链两端均可以用来偶联多肽,但经常偶联在5' 端(肽+ PNA)。多肽和PNA之间需加入起到空间间隔作用的O linker。

    肽核酸-多肽一个最普遍的应用就是用作抗微生物试剂,它是由CPP[最常见的(KFF)3K或(RXR)4xB]和含有10 - 15碱基的PNA分子组成,对微生物必需的基因具有反义作用。

    同样,在哺乳动物细胞中,使用CPP-PNA(设计的PNA对靶mRNA反义)可以很容易地建立反义寡核苷酸的方法。最常见的是,PNA设计在5' ATG 和上游区域。

    多肽-PNA另一种应用是基因芯片,可以从目标微生物中捕获反基因和转录基因。

   一般来说,肽核酸-多肽是在树脂上从C端到N端连续合成的。


Gamma PNA


    Gamma PNA在N-aminoethylglycine单元的gamma位C原子上具有手性中心。Gamma取代可在普通PNA每第三个残基处。

    每增加一个gamma取代,其 Tm就会提高5 - 8℃,可导致更高亲和力的序列特异性结合。此外,gamma PNA可以插入双链DNA中,形成三螺旋结构。

    此外,gamma PNA还有这样几个优点: 增加溶解性、不发生自凝聚、PNA-DNA结合更稳定和标记多样性及其他功能。

    合适的gamma功能基团

-赖氨酸:较好溶解性、两端可双标、细胞渗透。
 - MiniPEG:更好溶解性和特异性结合、有效的插入双链DNA中。

- 丙氨酸和谷氨酸也可以修饰。


设计PNA


   PNA低聚物可以在任一方向形成双链,但反平行方向优先。

   PNA / DNA的Tm一般比相应的DNA / DNA高。粗略地说,每一个碱基对可增加大约1℃。

  由于和互补DNA 序列高亲和性,通常不需要设计长链的PNA。最常见的PNA含有12-21个碱基。

  强烈建议避免任何自我互补序列,如反向重复序列,发夹和回文序列,这是因为PNA / PNA相互作用强于PNA / DNA。

  同样建议避免嘌呤含量高的序列,因为它们往往发生聚合,导致水溶性差。尽量使嘌呤含量低于60%。也尽量避免相邻嘌呤超过6个残基,特别是连续4个或更多的G残基。

为了提高PNA探针的溶解性,可在序列中加入一些助溶基团如O linker、E linker、X linker或者两个赖氨酸。


订购PNA


      PNA的价格取决于序列长度、产量和修饰标记,询价请说明具体要求。

最低订购量: 未标记PNA 50 nmole,标记PNA 25 nmole。提供PNA的纯度大于>95%,HPLC纯度分析报告、质谱分析报告。
一般2-3周交货,gamma PNA或修饰标记的3-4周交货。



PNA序列设计指南下载