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Muta-direct™定点突变试剂盒



产品名称

规格

货号

价格

Muta-Direct Site-Directed Mutagenesis Kit

15 rxn

SDM-15

950


 

概述

定点突变试剂盒可以在克隆于质粒DNA序列的特定位点诱导突变。理论上可以保证突变率达到100%。整个实验过程简单快捷只需要两个步骤。试剂盒不需要用到M13载体和甲基化步骤。该试剂盒可以诱导某个已知基因的特定碱基进行定点突变、再突变成野生型、密码子突变、插入或者缺失等,因此可以用于功能基因组学和蛋白质组学的研究。另外由于试剂盒能够诱导特异基因突变,又可以应用于蛋白质工程学研究领域。定点突变试剂盒操作十分简单(根据我们提供的引物设计原则设计引物;用Muta-direct™酶进行15~18个循环的PCR扩增反应;Mutazyme™酶处理选择突变克隆;转化)。理论上在LB平板上的克隆100%是突变克隆,通过对突变克隆的测序分析,正确的突变可以应用于后续实验。


产品特点


u         操作简便,无需特殊的实验技能

u       2-3天即可完成基因的定点突变

u         整个实验过程只需要用到两种酶:Muta-direct™酶和Mutazyme™酶

u         广泛的使用范围:可以用于点突变(Point mutation),缺失突变(Deletion)和插入突变(Insertion)等。

u         100%的突变效率


贮存条件

请将试剂盒中提供的各种试剂于-20℃贮存。由于试剂盒中提供的反应缓冲液及dNTP是为反应专门优化的,所以不要用其它的反应缓冲液及dNTP代替。


试剂盒组成


试剂盒提供的对照模板及引物,可以完成5次对照实验。包括对照反应在内,本试剂盒共可进行15次基因定点突变反应(每次反应体系50μl)。

               组成                                  

次量
Muta -Direct™Enzyme (2.5U/μl)          
15μl
Muta-Direct™Reaction Buffer (10×)  
100μl
dNTP Mixture  
30μl
Mutazyme™Enzyme (10U/μl)
15μl
pUC18 Control Plasmid (10ng/μl)  
10μl
Control Primer Mix (20pmol/µl)  
15µl
Competent cells  
Not provided


定点突变对照实验


试剂盒中提供的对照质粒为pUC18,通过它可以判断实验的成功与否。pUC18质粒包含lac Z基因,用试剂盒中提供的对照引物可以诱导pUC18中丝氨酸(TCG)突变为终止密码子(TAG),这样会导致lacZ基因失活,因此LB平板上的克隆必须都为白色才证明突变成功。对于首次做突变实验的用户,可以通过对照反应观察实验是否成功。


引物设计

n          首先需要进行引物设计,设计时请参考如下原则。

n          通常引物长度为25~45mer,我们建议引物长度为30~35mer

            注:突变位点应该设计在引物的中央位置。

n         如果设定的引物长度为30mer,接下来需要计算引物的Tm值,看是否达到78℃(GC含量应大于40%)。

n          如果Tm值低于78℃,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%)。

   ①     设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

   ②      计算引物的Tm值,看是否达到78℃,如果Tm值低于78℃,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%)。

   ③      最好使用经过纯化的引物。


    Tm值计算公式:Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5

    注:L:引物碱基数;% of GC:引物GC含量。


引物设计实例

        以GCGACG为例:

        5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3


首先设计30mer长的上下游引物,并将A(T)设计在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’


引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其 Tm=75.5(Tm=0.41×40-675/30+81.5)。通过计算可以看出其Tm低于78℃,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度。


重新调整引物长度。

Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’

Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’

在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物的GC含量为45.7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm为80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了。


实验前注意事项

l      试剂盒提供了优化的实验方案,按步骤操作诱导目的基因突变率几乎可达100%。

l      白色菌落的形成与突变效率是不同的,在实验过程中重要的是出现白色单菌落而不是菌落出现的数量。如果出现白色菌落则证明在目的基因上已经发生了突变。有时由于Mutazyme™处理步骤的失误,残留的模板质粒也能形成白色菌落。但如果您操作无误,这种情况一般不会发生。

l     白色菌落的数量与突变率是没有直接关系的,而与PCR反应条件和感受态细胞转化效率有关。

l   如果突变没有出现在目的核苷上时,请检测合成引物的纯度。

l    当PCR反应完成后,Mutazyme™酶的用量就会影响到实验结果。若模板过量会产生阴性结果,因此Mutazyme™和质粒模板的用量必须适当。

l     试剂盒适用于10kb以下的模板突变,但是当所用的质粒模板大于10kb时,白色菌落数量会减少,不过这与突变效率没有关系。



Muta-direct™定点突变试剂盒.doc



 

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