概述:
一步法总RNA提取试剂Redzol是由酚与异硫氰
酸胍组成的均相溶液。不仅可直接用于从人类、动
物、植物、细菌等细胞或组织中提取总RNA，而且还可以从样品中提取DNA或蛋白质。纯化的总RNA完整性好，不受蛋白、DNA的污染。可用于Northern
杂交、RNA点杂交、poly(A)+mRNA的分离、体外转
录、RT-PCR、RNase封阻分析以及分子克隆。
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目 录 号 |
规 格 |
价 格 |
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FTR-50 |
50ml |
150元 |
性能指标:
RNA产量一般为1-15μg RNA/mg组织或1×106 个细胞，A260/A280的比率一般在1.6~1.8之间。
使用优点:
操作简单：1小时即可完成整个RNA的提取，不仅 适用于小量组织（50~100mg）和细胞中（5×106） RNA的提取，还适用大量组织（>1g）和大量细胞 （>107）中RNA的提取。 纯度高：提取的总RNA不受蛋白、DNA等的污染。物美价廉：与其它进口同类产品相比质量相当，操作相同，但价格便宜将近一半。
物理特性:
红色透明液体，2~8℃保存，保存期限为12个月。 注意事项具有强的腐蚀性，若不慎接触皮肤，应立即用大量的洗涤剂和水进行冲洗；若感觉不舒适，应立即就诊。
注意事项:
具有强的腐蚀性，若不慎接触皮肤，应立即用大量的洗涤剂和水进行冲洗；若感觉不舒适，应立即就诊。
用户自备试剂:
1. 氯仿 2. 异丙醇 3. 75%乙醇（用DEPC处理的水） 4. DEPC水或0.5%SDS溶液
操作方法:
1.准备
估算Redzol或组织细胞的用量。每1ml Redzol的组织用量为50~100mg；细胞用量为5~106个
细胞。
2.组织或细胞的裂解
a、贴壁细胞
吸尽培养液，加入Redzol，用枪反复吹打数次，确保全部裂解，然后转移至新的离心管中。裂解
10cm2细胞需要1ml Redzol。
注：Redzol的加入量不是根据细胞数目来决定，而是根据细胞培养皿的面积（10cm2/ml）来决定。
b、悬浮细胞
离心收集细胞，吸尽液体，加入Redzol用枪吹打数次，确保全部裂解（某些酵母和细菌要用匀浆器匀浆才能全部裂解），然后转移至新的离心管中。按1ml Redzol可裂解5~10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞的比例加入Redzol裂解细胞。
注：应避免在Redzol加入前洗涤细胞，这样会增加mRNA降解的几率。
c、组织
先将新鲜组织剪成小块，放入匀浆器内，加入Redzol用匀浆器匀浆，然后转移至新的离心管中。
或者将组织在液氮中研磨成粉末后，加入Redzol中。每50~100mg的组织加入1ml Redzol进行裂解。
注：样品总体积不要超过所用Redzol体积的10%。
3.分相
a 将匀浆液15~30℃静置5分钟使其充分裂解。
b 每1ml Redzol中加入0.2ml的氯仿，震荡混匀后15~30℃静置2~3分钟。
c 2~8℃ 12,000g离心15分钟。离心后混合物分成三相（下面的酚/氯仿相、中间的白色界面、上
面的无色水相）。RNA全部在无色的水相中。
注：对于含有高浓度蛋白、脂肪、多糖或纤维素（肌肉、脂肪组织、植物的微管组织）的样品，在
分相前可以附加一个分离步骤：匀浆后2～8℃
12,000g离心10分钟弃沉淀。RNA溶解在上清液
中，纤维素、多糖、大分子量的DNA以不溶的形式沉淀从而与RNA分离。对于脂肪组织的样品，
上面一层脂肪组织可以被清除掉，将清澈的匀浆
液转移到另一新管中，继续进行第3步分相。
4.沉淀RNA
转移上层水相到另一新离心管中，按0.5ml异
丙醇/1ml Redzol 比例加入异丙醇，充分混匀后
15~30℃静置10分钟，然后2~8℃ 12,000g离心10
分钟，RNA形成白色的小团沉淀在离心管的底部和
侧面。
注：一定不要吸取中间界面；若同时提取DNA和
蛋白质，于4℃保留下层酚相。
5.洗涤RNA
弃上清，RNA沉淀于管底。按1ml 75%乙醇/
1ml Redzol加入75%乙醇，漂洗2~3次RNA沉淀，
2~8℃ 7,500g离心5分钟，尽量弃上清。
6.溶解RNA
在无菌工作台中干燥RNA沉淀5~10分钟。可用DEPC处理的50μl H2O、TE buffer 或0.5% SDS
溶解RNA样品，55-60℃温育10分钟使RNA完全溶解。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
常见问题解答：
每mg组织或106培养细胞的RNA产率 ：
| 肝和脾 | 6~10μg |
| 肾 | 3~4μg |
| 骨骼肌和脑 | 1~1.5μg |
| 胎盘 | 1~4μg |
| 上皮细胞 | 5~8μg |
| 纤维原细胞 | 5~7μg |
RNA产率低：
样品裂解或匀浆不完全；提取的RNA溶解不
完全。
A260/A280k<1.65：
紫外检测时RNA样品应用水稀释，不能用TE
稀释，低盐离子溶液和低pH值溶液致使其在280nm
的吸收值增加（Wilfinger, W. et. AL, Biotechniques
22: 474-481; Fox, D.K.(1998) Focus 20: 2 p.37）。样品
匀浆时加入试剂体积太少，匀浆后溶液分层不明
显，水相被酚污染。最后提取的RNA样品不能完全
溶解。
RNA降解：
使用的动物组织没有被立即冻上或放入Redzol
中匀浆；分离使用的样品或制备的RNA长期贮存在
了-5~-20℃，而不是贮存在-60℃~-70℃。提取RNA的细胞被胰蛋白酶分解，易导致提取的RNA降解。水相或使用的离心管没有完全处理仍残留有RNase。
变性凝胶电泳使用的甲醛pH值低于3.5。
RNA污染：
样品匀浆时加入试剂体积太少；分离使用的样品含有有机溶剂（乙醇，DMSO等），盐离子或碱溶
液。
蛋白多糖和多糖污染：
改进RNA沉淀方法：起始匀浆中每加1ml的
Redzol，水相中加入0.25ml的异丙醇和0.25ml的高盐溶液（0.8M的柠檬酸钠，1.2M的NaCl），混匀，离心，接着进行下一步RNA的提取。此方法有效的
沉淀了RNA，而蛋白多糖和多糖仍保留在水相中。
为了从多糖含量高的植物材料中获得高纯度的
RNA，推荐采用改进的RNA沉淀和起始匀浆液离心这些步骤。
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目 录 号 |
规 格 |
价 格 |
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FDP-10 |
10ml | 160元 |
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目 录 号 |
规 格 |
价 格 |
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FDW-250 |
250ml | 80元 |
RNasin是来源于人胎盘中的分子量为51,000道尔顿的蛋白质，它能特异性地与RNase以非共价键结
合形成复合体而使RNase失去活性。在pH5~8的条件下保持其活性，pH7.8时活性最高。该品为电泳纯，
无RNase，Nickase污染，比活为100,000单位/毫克蛋白。
浓度：20~40units/μl。
贮存建议：避免反复冻融。长期储存请于-70℃放置，短期经常使用请于-20℃放置。
单位定义：抑制5ng核糖核酸酶A 50%的活性所需的核糖核酸酶抑制剂的量为一单位。
贮存缓冲液：20mM Hepes-KOH, pH7.6, 50Mm KCl, 8mM DTT and 50%甘油。
质量控制：
1. 浓度为20~40units/μl。
2. 未检出核酸酶活性。
3. 用200单位核糖核酸酶抑制剂未检出核糖核酸酶活性（未经处理及预热）。
4. 用200单位核糖核酸酶抑制剂未检出蛋白酶活性。
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目 录 号 |
规 格 |
价 格 |
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FRN-1k |
1,000U | 120元 |
概述：
M-MLV反转录酶是一种依赖于RNA的DNA 聚合酶，反应需要DNA引物和RNA模板合成完整 的cDNA链。该酶是Moloney鼠白血病病毒的pol基 因的产物，由分子量为71KD的单个亚单位组成。该 酶只具有很弱的RNase H 活性，可用于较长的 cDNA链的合成。浓度为200units/μl，-20℃保存。
浓度：200U/μl
来源：Moloney鼠白血病病毒
应用：以RNA为模板合成cDNA链、RT-PCR
随酶附带缓冲液： 5×反应缓冲液（0.5ml）：250mM Tris-HCl， 375mM KCl，15mM MgCl2，0.2% Tween 20，pH8.3 100mM DTT（0.3 ml）
贮存缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl， 0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1% IGEPAL CA-630， 50% Glycerol，pH 7.6，-20℃保存。
活性定义：以Poly(A)/oligo(dT)为模板/引物， 在37℃、10分钟的条件下，使1nmol的dTTP掺入 酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活力单位 （U）。
质量检定：用200U的M-MLV反转录酶在 37℃~42℃孵育1μg的DNA和RNA 3小时，未检 测到DNA酶和RNA酶活性。
操作步骤：
cDNA第一链合成（20μl反应体系）
1. 在微量Tube管（例如0.2ml或0.5ml PCR管）中
加入下列成份：
模板总RNA/Poly(A)+ RNA 1μg/5ng-100ng
Oligo(dT)18或随机引物(dN)9 10-100pmol
DEPC处理水 适量
2. 70℃ 5分钟变性RNA和引物后，立即冰浴2分钟。
3. 加入下列反应液：
5×M-MLV buffer 4μl
100mM DTT 2μl
dNTP（各10mM） 1μl
RNasin 20U
M-MLV RTase 200U
步骤1+步骤3总反应体积20μl
4. 轻轻弹匀。
5. 用Oligo(dT)18时42℃保温1小时；用随机引物(dN)9 时37℃保温1小时。
6. 94℃ 5分钟，使M-MLV反转录酶变性失活，4℃ 或冰上冷却。得到的反应液用于下一步PCR反 应。
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目 录 号 |
规 格 |
价 格 |
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FMM-10k |
10,000U | 370元 |
概述：
该试剂盒综合了Redzol和硅胶膜离心纯化柱的优点，将二者有机地结合在一起，缩短了实验时间，简化了操作步骤，能更有效地去除DNA和蛋白质的污染，使提取的RNA纯度更高、产量更多。试剂盒中每个离心纯化柱每次可处理50~100mg组织或5~10×106个细胞，在45分钟内能同时处理多个样品。纯化的RNA可用于Northern杂交、RNA点 杂交、Poly(A)+mRNA的分离、体外转录、RT-PCR、 RNase封阻分析等。
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目 录 号 |
规 格 |
价 格 |
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FTRI-50 |
50次 | 220元 |
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1、2泳道为Trizol试剂提取的总RNA； |
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Redzol（一步法总RNA提取试剂）与总RNA提纯试剂盒提取大豆总RNA对比 |
试剂盒包装及组成:
1. Redzol试剂50ml
2. 硅胶膜离心纯化柱50套
3. RNA洗涤液40ml
4. DEPC处理水3ml
5. 产品说明书1份
1. 经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能 有RNase，会导致RNase污染。
2. 吸头应用DEPC处理，避免交叉污染。
3. 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿，用DEPC处理即可。
操作步骤：
1.准备
估算Redzol或组织细胞的用量。每1ml Redzol
的组织用量为50~100mg；细胞用量为5~10×106个
细胞
2.组织或细胞的裂解
贴壁细胞
吸尽培养液，加入Redzol，用移液器反复吹打
数次，确保全部裂解，然后转移至新的离心管中。裂
解10cm2细胞需要1ml Redzol。
注：Redzol的加入量不是根据细胞数目来决定，而
是根据细胞培养皿的面积（10cm2/ml）来决定。
悬浮细胞
离心收集细胞，吸尽液体，加入Redzol用移液
器吹打数次，确保全部裂解（某些酵母和细菌要用
匀浆器匀浆才能全部裂解），然后转移至新的离心
管中。按1ml Redzol可裂解5~10×106动物、植物、
酵母细胞或1×107细菌细胞的比例加入Redzol裂
解细胞。
注：应避免在Redzol加入前洗涤细胞，这样会增
加mRNA降解的几率。
组织
先将新鲜组织剪成小块，放入匀浆器内，加入
Redzol用匀浆器匀浆，然后转移至新的离心管中。或者将组织在液氮中研磨成粉末后，加入Redzol
中。每50~100mg的组织加入1ml Redzol进行裂解。
注：样品总体积不要超过所用Redzol体积的10%。
3.分相 a. 将匀浆液15~30℃静置5分钟使其充分裂解。 b. 每1ml Redzol中加入0.2ml的三氯甲烷（氯 仿），震荡混匀后15~30℃静置2~3分钟。 c. 12,000rpm离心15分钟。离心后混合物分成 三相（下面的酚/氯仿相、中间的白色界面、上面 的无色水相）。RNA全部在无色的水相中。 注：对于含有高浓度蛋白、脂肪、多糖或纤维素 （肌肉、脂肪组织、植物的微管组织）的样品，在 分相前可以附加一个分离步骤，匀浆后12,000rpm 离心10分钟弃沉淀。RNA溶解在上清液中，纤维 素、多糖、大分子量的DNA以不溶的形式沉淀从 而与RNA分离。对于脂肪组织的样品，上面一层 脂肪组织可以被清除掉，将清澈的匀浆液转移到 另一新管中，继续进行第3步分相。
4.柱纯化 a. 转移上层水相到另一新的1.5ml离心管中， 加入200μl无水乙醇，颠倒混匀。 b. 将混合液吸入离心纯化柱（硅胶膜）中，静 置3分钟，12,000rpm离心2~3分钟。 c. 倒掉收集管中的废液，将离心纯化柱重又套 入收集管中。加入600μl RNA洗涤液，12,000rpm离 心1分钟，倒掉收集管中的废液。 d. 12,000rpm再离心2分钟，尽量除尽液体。将 离心纯化柱套入干净的1.5ml离心管中，加入50μl DEPC处理的超纯水或0.5% SDS于离心纯化柱正中 （不要粘在管壁上），静置1~2分钟，12,000rpm离心 1分钟。 e. 将洗脱液吸入离心纯化柱中再洗脱一次，以提高RNA的回收量。洗脱下来的液体即是纯化的 RNA，-20℃保存。
常见问题解答：
每mg组织或106培养细胞的RNA产率：
肝和脾6~10μg
肾3~4μg
骨骼肌和脑1~1.5μg
胎盘1~4μg 上皮细胞5~8μg
纤维原细胞5~7μg
RNA产率低：
样品裂解或匀浆不完全；提取的RNA溶解不 完全。
A260/A280<1.65：
紫外检测时RNA样品应用水稀释，不能用TE 稀释，低盐离子溶液和低pH值溶液致使其在280nm 的吸收值增加（Wilfinger, W. et. al, Biotechniques 22: 474-481; Fox, D.K.(1998) Focus 20: 2 p.37）；样品 匀浆时加入Redzol试剂体积太少，匀浆后溶液分层 不明显，水相被酚污染；最后提取的RNA样品不能 完全溶解。
RNA降解：
使用的动物组织没有被立即冻上或放入Redzol 中匀浆；分离使用的样品或制备的RNA长期贮存 在-5~-20℃，而不是贮存在-60℃~-70℃；提取RNA 的细胞被胰蛋白酶分解，易导致提取的RNA降解； 水相或使用的离心管仍残留有RNase；变性凝胶电 泳使用的甲醛pH值低于3.5。
DNA污染：
样品匀浆时加入试剂体积太少；分离使用的样品 含有有机溶剂（乙醇，DMSO等），盐离子或碱溶液。
概述：
本试剂盒提供了由总RNA或mRNA合成cDNA 第一链所需要的全部试剂，同时根据实验的不同要 求及目的提供了两种合成cDNA 第一链的引物： oligo(dT)18和随机九聚物(dN)9。试剂盒中的M-MLV 反转录酶是一种依赖于RNA的DNA聚合酶，该酶 是鼠白血病毒的pol基因的产物，由分子量为71kD 的单个亚单位组成，具有很弱的RNase H活性。在 M-MLV反转录酶作用下，利用oligo(dT)18或者随机 引物(dN)9合成与mRNA相应互补的cDNA第一链。
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目 录 号 |
规 格 |
价 格 |
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FFS-25 |
25次 | 320元 |
试剂盒包装及组成: 25次
1. M-MLV Reverse Transcriptase（200U/μl） 2500U/12.5μl
2. 5×M-MLV Buffer 100μl
3. 100mM DTT 50μl
4. dNTPs（10mM each） 25μl
5. RNasin（40U/μl） 250U/6.25μl
6. Oligo(dT)18（20pmol/μl） 0.5OD/tube
7. (dN)9（20pmol/μl） 0.5OD/tube
8. DEPC-treated water 1.5ml
操作方法：
1、逆转录反应
（1）在无菌薄壁管中加入以下成份： Total RNA 0.5~1.0μg (dN)9 or oligo(dT)18 100pmol
（2）混匀后，70℃变性5min，将薄壁管迅速置于冰 上冷却，然后依次加入以下成份： 5×M-MLV Buffer 4μl dNTPs（10mM each） 1μl RNasin 10U100mM DTT 2μl M-MLV Reverse Transcriptase 100U DEPC-treated water up to 20μl
（3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT)18引物时在42℃， 使用随机引物(dN)9时在37℃下温育1小时。
（4）94℃ 5min终止反应后，冰上冷却。
（5）合成的cDNA第一链可直接用于PCR扩增或进 行其它下游操作。
2、PCR扩增
（1）在PCR薄壁管中加入以下试剂 Synthesized cDNA 2-5μl 10×PCR Buffer 2μl Upper primer 10pmol Lower primer 10pmol dNTPs（10mM each） 0.5μl Taq DNA Polymerase 1.5U ddH2O up to 20μl
（2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。 94℃预变性2.5min。进入下列30~40个循环（此扩 增条件仅供参考）：94℃ 30sec，60℃ 45sec，72℃ 1min~3min。最后72℃延伸7min。
注意事项：
1、确保RNA完整性及纯度。RNA质量是决定合成 cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性 可由OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检 测。较纯的RNA样品OD260/OD280比值通常为1.8 ~2.0，若该比值偏低，应进一步纯化。真核生物 RNA样品电泳图谱28s和18s的比值约为2:1，否 则，表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。进行cDNA合成所用的器皿、 试剂和溶液必须完全无菌。操作过程始终戴手套以杜绝各种RNA酶的污染。 3、合成cDNA第一链的引物选择。选择oligo(dT)12-18 作为反转录引物，可保证cDNA具有完整的3'端， 通常可得到接近全长的cDNA第一链；若选择随 机寡核苷酸(dN)6或(dN)9作为引物，引物在整个 mRNA的多个位点退火，产生短的部分长度的 cDNA第一链。这种方法经常用于获得5'末端序 列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复 制的终止位点的RNA模板获得cDNA。
常见问题及参考意见：
1、cDNA产量很低，为什么？ 可能的原因：
(1)RNA模板质量低；
(2)对mRNA 浓度估计过高；
(3)反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足；
(4)反应体积过大，一般不应超 过50μl。
2、合成不了长链的cDNA，为什么？
(1) RNA降解。对使用的器具、试剂用DEPC、干 热或湿热灭菌处理，以杜绝RNase污染。同时， 在逆转录反应中加入RNase抑制剂。
(2) 反应条件不合适。通过预实验确定最合适的反应 条件，包括酶量、盐浓度、反应温度（37~56℃）、 DTT浓度（0.5~10mM）。
(3) RNA结构问题。提高逆转录反应温度，或者使 用随机引物。
注：经本公司实验证明某些DEPC处理水可能 对Taq DNA聚合酶有抑制作用，因此PCR扩增时 建议最好使用超纯水。
概述：
本试剂盒提供了由总RNA或mRNA合成cDNA 第一链及PCR扩增所需要的全部试剂，同时根据实 验的不同要求及目的提供了两种合成cDNA第一链 的引物：oligo(dT)18和随机九聚物(dN)9。试剂盒中 的M-MLV反转录酶是一种依赖于RNA的DNA聚 合酶，该酶是鼠白血病毒的pol基因的产物，由分 子量为71kD的单个亚单位组成，具有很弱的RNase H活性。在M-MLV反转录酶作用下，利用oligo(dT)18 或者随机引物合成与mRNA相应互补的cDNA第一 链，然后以cDNA为模板利用本试剂盒提供的PCR 相关产品进行PCR扩增。本试剂盒含有从RNA到 cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部 试剂，可以简便而有效地对RNA进行扩增分析。
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目 录 号 |
规 格 |
价 格 |
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FTRP-25 |
25次 | 550元 |
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1、2泳道为Trizol试剂提取的总RNA； |
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cDNA第一链合成试剂盒与两步法RT-PCR试剂盒扩增结果电泳图 |
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试剂盒包装及组成:
25次
1. M-MLV Reverse Transcriptase（200U/μl） 2500U/12.5μl
2. 5×M-MLV Buffer 100μl
3. 100mM DTT 50μl
4. dNTPs（10mM each） 37.5μl
5. RNasin（40U/μl） 250U/6.25μl
6. Oligo(dT)18（20pmol/μl） 0.5OD/tube
7. (dN) 9（20pmol/μl） 0.5OD/tube
8. DEPC-treated water 1.5ml
9. Taq DNA聚合酶（5U/μl） 50U/10μl
10.10×PCR Buffer 50μl
操作方法：
1. 逆转录反应
（1）在无菌薄壁管中加入以下试剂 Total RNA 0.5～1μg (dN)9 or oligo(dT)18 100pmol
（2）混匀后，70℃变性5min，将薄壁管迅速置于冰 上冷却，然后依次加入以下试剂：
5×M-MLV Buffer 4μl
dNTPs（10mM each） 1μl
RNasin 10U 100mM DTT 2μl
M-MLV Reverse Transcriptase 100U
DEPC- treated water up to 20μl
（3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT)18引物时在42℃， 使用随机引物(dN)9时在37℃下温育1小时。
（4）94℃ 5min终止反应后，冰上冷却。
（5）合成的cDNA第一链可直接用于PCR扩增或进 行其它下游操作。
2. PCR扩增
（1）在PCR薄壁管中加入以下试剂
Synthesized cDNA 2-5μl
10×PCR Buffer 2μl Upper primer
10pmol Lower primer 10pmol
dNTPs(10mM each) 0.5μl
Taq DNA Polymerase 1.5U
ddH2O up to 20μl
（2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。 94℃预变性2.5min。进入下列30~40个循环（此 扩增程序仅供参考）：94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1min~3min。最后72℃延伸7min。
注意事项：
1、确保RNA完整性及纯度。RNA质量是决定合成 cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性 可由OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检 测。较纯的RNA样品OD260/OD280比值通常为 1.8~2.0，若该比值偏低，应进一步纯化。真核生 物RNA样品电泳图谱28s和18s的比值约为2:1， 否则，表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。进行cDNA合成所用的器皿、 试剂和溶液必须完全无菌。操作过程始终戴手套 以杜绝各种RNA酶的污染。 3、合成cDNA第一链的引物选择。选择oligo(dT)12～18作为反转录引物，可保证cDNA具有完整的3'-端，通常可得到接近全长的cDNA第一链；若选择随机寡核苷酸(dN)6或(dN)9作为引物，引物在整个mRNA的多个位点退火，产生短的部分长度的cDNA第一链。这种方法经常用于获得5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获cDNA。
常见问题及参考意见：
1、cDNA产量很低，为什么？可能的原因：
(1)RNA模板质量低；
(2)对mRNA 浓度估计过高；
(3)反应体系中存在反转录酶抑制剂 或反转录酶量不足；
(4)反应体积过大，一般不应超 过50μl。
2、合成不了长链的cDNA，为什么？
（1）RNA降解。对使用的器具、试剂用DEPC、干 热或湿热灭菌处理，以杜绝RNase污染。同时， 在逆转录反应中加入RNase抑制剂。
（2）反应条件不合适。通过预实验确定最合适的反 应条件，包括酶量、盐浓度、反应温度（37~56℃）、 DTT浓度（0.5~10mM）。
（3）RNA结构问题。提高逆转录反应温度，或者使 用随机引物。
概述:
本试剂盒提供了一步法RT-PCR反应所需的全 部试剂，整个RT及PCR反应在同一体系中进行，中 间不需添加任何试剂。试剂盒中的AMV反转录酶 是由AMV分离而来的分子量约157,000道尔顿的 αβ型全酶。在AMV反转录酶作用下，可以完成由 RNA反转录为cDNA的过程，再由优化的Taq DNA 聚合酶扩增cDNA。一步法可使RT及PCR过程在 配方独特的10×RT-PCR缓冲液中一次完成，使操 作更加简便、快捷，并避免了中间加样可能发生的 污染。
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目 录 号 |
规 格 |
价 格 |
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FTRP-25 |
25次 | 580元 |
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试剂盒包装及组成:
| 25次 | ||
| AMV Reverse Transcriptase（25U/μl） | 5μg | |
| U-Taq DNA Polymerase（5U/μl） | 25μg | |
| 10×RT-PCR Buffer | 50μg | |
| dNTP Mixture（10mM each） | 25μl | |
| RNasin（40U/μl）） | 7.5μl | |
| DEPC-treated water | 0.5ml | |
操作方法：
| 在0.2ml或0.5ml薄壁管中加入下列成份 | |
| 总RNA） | ～0.5μg |
| Upper primer | 10~30pmole |
| Lower primer | 10~30pmole |
| 10×RT-PCR Buffer | 2μl |
| dNTP Mixture（10mM each） | 1μl |
| AMV Reverse Transcriptase | 5μl |
| U-Taq DNA polymerase | 5μl |
| RNasin | 10μl |
| DEPC- treated water | up to 20μl |
每mg组织或106培养细胞的RNA产率轻轻混匀，短暂离心。45℃温育30~45min，95℃5min终止反应。进入以下30个循环： 94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1~3min。最后72℃延伸7min。扩增完毕取5~10μl电泳。
常见问题及参考意见：
1、cDNA产量很低，为什么？可能的原因：
(1)RNA模板质量低；
(2)对mRNA 浓度估计过高；
(3)反应体系中存在反转录酶抑制剂 或反转录酶量不足；
(4)反应体积过大，一般不应超 过50μl。
2、合成不了长链的cDNA，为什么？
(1) RNA降解。对使用的器具、试剂用DEPC、 干热或湿热灭菌处理，以杜绝RNase污染。同时，在 逆转录反应中加入RNase抑制剂。
(2) 反应条件不合适。通过预实验确定最合适 的反应条件，包括酶量、盐浓度、反应温度（37~56℃） 及PCR反应条件等。
(3) RNA结构问题。提高逆转录反应温度。
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简 介: |
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反应体系 |
20µl反应体系 | 50µl反应体系 | |
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模板RNA |
总RNA | 0.5~1.0µg | 1.0~2.0µg |
| Poly(A)RNA | 0.05~0.1µg | 0.1~0.2µg | |
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引物 |
特异引物 | 10~30pmol | 20~50pmol |
| Oligo(dT)18 | 0.5µg | 1.0µg | |
| 随机引物 | 0.05~0.25µg | 0.1~0.5µg | |
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2. 将其70℃温育5分钟后放置冰上。 |
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42℃ |
60分钟（cDNA合成） |
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94℃ |
5分钟（反转录酶失活） |
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逆转录完成后接着进行PCR扩增，可用傻瓜PCR反应体系继续进行PCR操作： |
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目 录 号 |
品 名 及 规 格 |
价 格 |
| FRT-2.5 | RT PreMix，25管，0.5ml薄壁管，20µl体系 | 360元 |
| FRT-2.2 | RT PreMix，25管，0.2ml薄壁管，20µl体系 | 360元 |
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简
介 |
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模板RNA和引物在反应体系中的用量 ： |
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反应体系 |
20µl反应体系 | |
| 模板RNA | 总RNA | 0.5~1.0µg |
| Poly(A)RNA | 0.05~0.1µg | |
| 引物 | 上游引物 | 10~30 pmol |
| 下游引物 | 10~30pmol | |
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2. 将其70℃温育5分钟后放置冰上。 |
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常见问题及参考意见:
1. RNA结构特点及RNase的作用？ RNA是由4种（2'未脱氧的）核苷酸A、U、 G、C的单链构成的聚合物。2'-OH对RNA分子 的理化性能有重要影响：
（1）RNase对RNA的降 解作用通过2'-OH进行，不再需要DNase必须的 工作金属离子的参与便可完成；
（2）RNA分子在 强碱条件下，通过2'-OH参与形成2'、3'磷酸二 酯（环）自发水解，因此在无RNase的水溶液中 其稳定性也远远低于DNA；
（3）RNase为较小的单肽链蛋白，尤其是具有较多的二硫键（4对）， 使得RNase的结构特别紧凑，100℃ 20分钟也不 会失活，高压灭菌也不会使之变性。因此，RNA 极易受RNase的攻击而降解，导致实验失败。
2. 操作RNA注意事项？
由于RNA 酶的高稳定性、广泛存在性和 RNA的不稳定性，在有关RNA操作的实验中须 十分小心。
（1）指定特定的区域作为操作RNA专用区，保持实 验室低温、清洁的环境，减少空气流动，实验 前用RNA酶灭活剂和75%乙醇擦拭实验台。
（2）实验过程中需戴口罩及一次性手套，接触可能 污染RNA酶的物品后要更换手套。
（3）对于内源RNase的抑制，根据实验特点采取不 同方法。如体外转录、合成cDNA第一链等实 验，加入RNase的专一抑制剂（RNasin）；对于 RNA的分离制备采用非特异的蛋白变性剂，如 异硫氰酸胍-巯基乙醇联合变性的方式等。
（4）对于外源RNase，凡不能用高温烘烤的材料如 塑料容器等，通常用0.1% 的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液37℃浸泡12小时以上，高温灭 菌并烘干后使用。DEPC是RNA酶的化学修饰 剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反 应而抑制酶活性。所用玻璃器皿需置于干燥烘 箱中200℃烘烤2小时以上或180℃烘烤12小时 以上，冷却备用。 实验所用试剂也可用DEPC 处理，加入 DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再 煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC， 否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活 性。配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处 理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。注意： DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使 用时需小心。DEPC能与胺和巯基反应，因而含 Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。
（5）用作RNA分析的电泳槽要用1%SDS清洗，用 水冲洗后，然后用无水乙醇清洗，最后用3%双 氧水浸泡10分钟。使用前再用DEPC处理水冲 洗电泳槽。
3. cDNA产量很低，为什么？
可能的原因：
（1）RNA模板质量低；
（2）对 mRNA浓度估计过高；
（3）反应体系中存在反转 录酶抑制剂或反转录酶量不足；
（4）反应体积过 大，一般不应超过50μl。
4. 进行RT-PCR实验时，产生弥散条带，为什么？
（1）在PCR反应体系中第一条链产物的含量过 高；
（2）引物的用量过高；
（3）没有优化PCR反 应条件及循环参数；
（4）在用DNase处理被DNA 污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产 生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。
5. 进行RT-PCR实验时，在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物，为什么？
可能原因 |
建议解决方法 |
| RNA被降解 | 在变性胶上验证RNA的完整性 |
| 使用无污染技术分离RNA | |
| 将组织从动物体取出后立即处理 | |
| 在100%甲酰胺中储存RNA | |
| 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否 则抑制剂会稀释所有结合的RNase |
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| RNA中包含逆转录抑制剂 | 通过乙醇沉淀RNA，然后用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行漂洗。逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺、甲酰胺 和胍盐 |
| 将对照RNA同样品混合，与对照RNA反应比较产量以检测抑制剂 | |
| 多糖同RNA共沉淀 | 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖 |
| 用于合成cDNA第一链的没有很好退火 | 确定退火温度是否适合您的Oligo DNA。对于随机六聚体，Oligo DNA建议在反转录保温之前先在25℃保温10分钟 |
| 对于基因特异性Oligo DNA（GSP），可以试用一下其他GSP，或换 用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列 |
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| 起始RNA量不够 | 增加RNA量 |
| 对于<50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到 0.5μg乙酰BSA |
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| RNA模板二级结构太多 | 将RNA和Oligo DNA在不含盐及缓冲液条件下变性、退火 提高逆转录反应温度 |
| 靶序列在分析的组织中不表达 | 尝试其他靶序列或组织 |
| PCR没有起作用 | 对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应 产物 |
| PCR Oligo DNA设计较差 | 避免在Oligo DNA3'端含有互补序列 |
| 避免可以形成内部发卡结构的序列 | |
| 设计Tm值接近的Oligo DNA | |
| 目的序列不在目的RNA上 | 重新设计实验，或尝试用其它来源的目的RNA |
| 模板GC含量太高 | 对于GC含量>50%的模板，使用改善GC含量的优化剂 |
| 模板浓度太低 | 使用103拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号 |
| 镁离子浓度太低 | 从1～3mM间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和 镁离子浓度太低Oligo DNA对的最佳镁离子浓度。注意：对于Real Time PCR， 使用3～5mM的镁离子浓度 |
| 退火温度太高 | 将退火温度设定为低于Tm值5℃进行PCR反应，真正的退火温度 实际会高些或低些 |
| Oligo DNA浓度太低 | 最佳Oligo DNA浓度介于0.1μM到0.5μM之间 |
| 特异Oligo DNA（GSP）设计较差 | 遵循Oligo DNA设计原则 |
可能原因 |
建议解决方法 |
反应条件不是最佳 |
优化镁离子浓度及退火温度 |
| 使用镁离子前将其震荡混匀 | |
引物设计不合理 |
确认引物无自身互补，或两条引物不互补，尤其在近3'端 |
| 检查PCR引物的长度和Tm | |
| 避免在引物的3'端使用3个连续的G或C | |
体系被另一目的RNA/DNA污染 |
加样时使用正排式移液管、气阻枪头以减少交叉污染 |
| 在扩增前或扩增后分别应用独立的操作区域和加样器 | |
| 戴手套并经常更换 | |
| 采用UNG或其它灭菌方法来防止DNA遗留到后续反应中 | |
Oligo DNA和模板非特异性 在第一链合成中使用GSP,而不是随机Oligo DNA或Oligo(dT) 退火 |
在第一链合成中使用GSP,而不是随机Oligo DNA或Oligo(dT) |